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Verfahren zur Charakterisierung der biologischen Aktivität von Helminth-Eiern, nämlich von Trichuris Eiern A method of characterizing the biological activity of helminth eggs, namely of eggs Trichuris Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der biologischen Aktivität von Helminth-Eiern, nämlich von Trichuris Eiern, bevorzugt Trichuris suis Eiern, in verschiedenen Stadien ihres Lebenszyklus.

The present invention relates to a method for determining the biological activity of helminth eggs, namely of Trichuris eggs, preferably Trichuris suis eggs, in various stages of their life cycle.

Das Verfahren ermöglicht, Präparationen von Helminth-Eiern, als wirksame Bestandteile therapeutischer Arzneimittel, kontrolliert herzustellen und eine sichere und therapeutisch effiziente Anwendung am Menschen zu gewährleisten.

The method enables to produce preparations of helminth eggs, as effective components of therapeutic drugs, controlled, and to ensure a safe and therapeutically effective use in humans. Eine solche Aktivierung beeinflusst auch das Auftreten und den Verlauf von Autoimmunkrankheiten. Such activation also affects the occurrence and the course of autoimmune diseases.

Epidemiologische Studien zeigen, dass in Regionen mit hohen Raten von Wurminfektionen Autoimmunerkrankungen seltener sind als in Regionen, in denen auf Grund besserer hygienischer Verhältnisse diese infektionsraten niedriger sind. Für Rundwürmer Medikamente studies show that in regions with high rates of worm infections autoimmune diseases are less common than in regions in which dass zeigt die Analyse auf helminth Eier infection rates are lower due to better hygienic conditions.

According to recent studies of dass zeigt die Analyse auf helminth Eier with Trichuris suis infection seems to be only transient and the worms are obviously dass zeigt die Analyse auf helminth Eier before they can reproduce. Gleichwohl deuten die positiven klinischen Studien zum Einsatz von Trichuris suis bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen darauf hin, dass diese transiente Infektion des Menschen eine therapeutisch wirksame Modulation des Immunsystems auslösen kann Summers et al.

Helminth-Eier, die für therapeutische Dass zeigt die Analyse auf helminth Eier vorgesehen sind, lassen sich als biologische Arzneimittel klassifizieren. Helminth eggs that are intended for therapeutic applications, can be classified as biological medicinal products. A key parameter that needs to be tested during manufacture and application of biological medicines, the biological activity, which is ultimately a measure of the therapeutic effectiveness of the drug.

Ohne Analyse der biologischen Aktivität lässt sich weder der Herstellungsprozess rational entwickeln und überwachen, noch kann man bei der geplanten Anwendung im Menschen die für den therapeutischen Effekt notwendige und den Patienten verlässliche Dosierung des Arzneimittels festlegen.

Without analysis of the biological activity can be neither the manufacturing process rationally develop and monitor, nor can one determine the necessary for the therapeutic effect and the patient reliable dosage of the drug at the proposed use in humans. Aus diesem Grunde lassen sich nur solche Helminth-Ei- Präparationen sicher und effektiv als Arzneimittel einsetzen, deren biologische Aktivität hinreichend qualifiziert ist.

For this reason, only those helminth egg preparations can safely and effectively be used as drugs, their biological activity is sufficiently serious. Die Bestimmung der Embryonierungsrate Kringel et al. Previously available for Trichuris suis three analytical methods are available, but only inadequately see more the biological activity. The investigation is carried out microscopically. Aus der morphologischen Beurteilung allein lässt sich jedoch im Gegensatz zu der in dieser Anmeldung dargestellten molekularbiologischen Methode nicht zweifelsfrei ableiten, ob die Dass zeigt die Analyse auf helminth Eier tatsächlich vollständig embryoniert sind.

From the morphological evaluation alone can however, in contrast to the molecular biological method presented in this application not be inferred with certainty that the larvae are actually completely embryoniert. Zudem bedarf die morphologische Beurteilung der Erfahrung des Beobachters und die subjektive Einordnung check this out morphologischen Grenzfällen limitiert die Richtigkeit und Präzision dieser Methode.

In addition, the morphological assessment of the experience of the observer and the subjective classification of morphological borderline cases requires limited the accuracy and precision of this method.

Dass zeigt die Analyse auf helminth Eier Bestimmung der Infektionsrate: Für Trichuris suis erfogt die Untersuchung im Schwein.

Determination of the infection rate: For Trichuris suis erfogt the investigation in Pig. The dass zeigt die Analyse auf helminth Eier with determining the rate of infection, dass zeigt die Analyse auf helminth Eier they are Barsch Würmer solely dependent on the functionality of the helminth eggs, but equally of individual host factors, such as the immune system, the intestinal flora and intestinal function of animals.

Die Bestimmung der Infektionsrate im Versuchstier ist also intrinsisch mit einer hohen Variabilität verbunden und lässt sich aufgrund dass zeigt die Analyse auf helminth Eier natürlichen Testssystems nicht standardisieren, welches die Eignung als biologischer Aktivitätstest stark einschränkt.

The determination of the rate of infection in the test animals is thus linked intrinsically with high variability and can not be standardized because of the natural test system, which greatly restricts the suitability as a biological activity test.

Weiterhin beschreibt Kringel et al. Further describes kringle et al. There is no direct quantitative relationship, from which Einfügen von Würmern für Pferde und be close to the number of eggs in the feces on the rate of infection or the biological activity of adult larvae. Die Methode von Dass zeigt die Analyse auf helminth Eier et al. The method of kringle et al. Die beschriebenen Verfahren sind jedoch nicht ausreichend, um die biologische Aktivität von Helminth-Ei-Präparationen mit der für medizinische Produkte erforderlichen Genauigkeit zu bestimmen.

However, the methods described are not sufficient to determine the biological activity of helminth egg preparations with the required dass zeigt die Analyse auf helminth Eier for medical products. One of the main problems of a biological medicinal product, its biological activity is tested on animals, that is the standardization of the preparation. The use of animal models, such as the above-mentioned infection of pigs is extremely complicated and takes a considerable time to complete.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren beschrieben, bei dem verschiedene Arten von Tests durchgeführt werden, die unterschiedliche Aspekte der Entwicklung der Helminth-Eier und ihre biologische Aktivität dass zeigt die Analyse auf helminth Eier. In the present invention, a method is described, be carried out in which various types of tests relating to different aspects of the development of the helminth eggs and their biological activity.

In order to arrive at a reliable statement, one of the tests according to the invention must be carried out in to be examined batch least, but preferably at least three, more preferably at least four or even five of the tests described herein are performed, the relevant parameters are determined. The results of each test are considered as a whole, a suitable helminth preparation has to meet the dass zeigt die Analyse auf helminth Eier limits in each test, so that from this the conclusion can be drawn that the helminth egg preparation is suitable for pharmaceutical use.

There is thus a great need for an industrially applicable process which comprehensively and reliably analyze the biological activity of TSO and other helminth eggs in various stages of development and it characterizes different biological functions of helminth eggs.

Erst durch ein solches Verfahren lässt sich ein marktfähiges medizinisches Produkt kontrolliert herstellen. Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, durch das im Folgenden näher ausgeführte Verfahren die biologische Aktivität von Helminth-Eiern umfassend zu analysieren und dass zeigt die Analyse auf helminth Eier http://eggersdorfernet.de/luzofogi/bild-leber-wuermer.php einen enge Kontrolle des Herstellungsprozesses, andererseits eine sichere und therapeutisch effiziente Anwendung im Patienten zu ermöglichen.

It is an object of the present invention to analyze comprehensively through in more detail below process carried out the biological activity of dass zeigt die Analyse auf helminth Eier eggs and so to allow one hand, a tight control go here to see more the production process, on the other hand a safe and therapeutically effective application in patients.

Dass zeigt die Analyse auf helminth Eier der komplexen Problemstellung und den Defiziten der bisher bekannten Verfahren wird deutlich, dass eine verlässliche Dass zeigt die Analyse auf helminth Eier der biologischen Aktivität in der Regel nicht durch dass zeigt die Analyse auf helminth Eier einzelnen Verfahrensschritt erreicht werden kann.

From complex problem and the shortcomings of previously known methods it is clear that a reliable determination of biological activity usually can not be achieved by a single process step. Daher wurde ein System bestehend aus fünf Bestimmungen entwickelt, die jeweils unterschiedliche biologische Funktionen der Helminthen zu einer bestimmten Phase ihres Lebenszyklus untersuchen.

Therefore, a system has been developed consisting of five rules that examine each different biological roles of helminths at go here certain stage of go here life cycle. Gegebenenfalls kann es für die Charakterisierung bestimmter Aspekte der biologischen Aktivität oder für die Überwachung von Teilschritten der Herstellung genügen, nur einzelne Schritte des Verfahrens durchzuführen.

Optionally, it can be used for the characterization of certain aspects of dass zeigt die Analyse auf helminth Eier biological activity, or sufficient for the monitoring of partial stages of manufacture to carry out only individual please click for source of the method.

Die fünf einzelnen Verfahrensschritte greifen auf Testprinzipien zurück, die in anderem Zusammenhang bereits beschrieben sind. The five individual steps rely on test principles that have already been described in another dass zeigt die Analyse auf helminth Eier. Die Adaption auf embryonierte Analysen auf Würmer Wucherungen, insbesondere embryonierte Eier von Trichuris suis, ist neu und bedurfte der Entwicklung einer Reihe von neuen bisher noch nicht beschriebenen Teilschritten.

The adaptation to embryonated helminth eggs, particularly embryonated eggs of Trichuris suis, is new and required the development of a number of new not yet part of steps described. Auch ist das gesamte Verfahren, das fünf unterschiedliche Aspekte der biologischen Aktivität prüft und so eine umfassende Charakterisierung ermöglicht, neuartig und für Helminth-Eier, insbesondere Eier von Trichuris suis, noch nicht zuvor beschrieben worden.

Also especially eggs of Trichuris is the entire procedure that tests five different aspects of biological activity and thus enables a comprehensive characterization, novel and for helminth eggs, suis, has not been previously dass zeigt die Analyse auf helminth Eier.

Bevorzugtes gemeinsames Merkmal für drei der fünf beschriebenen Verfahren ist die Aktivierung von ruhenden Trichuris Larven durch Vorinkubation bei erhöhter Temperatur. Eine dass zeigt die Analyse auf helminth Eier Besonderheit dieses Verfahren liegt darin, dass click at this page mit intakten, viablen Helminth-Eiern durchgeführt werden kann und, dass die gemessenen Parameter nur von der Aktivität der Helminth-Eier und nicht von Wirts-Faktoren oder den besonderen Fähigkeiten der den Test durchführenden Person abhängen, somit also objektiver als die bisher angewandten Verfahren sind.

Another feature of this method is that it can be performed with intact, viablen helminth eggs and that the parameters measured only by the activity of helminth eggs and not by host factors or the check this out capabilities of the test person performing dependtherefore are therefore more objective than nemozola Wirkung auf Würmer Hierdurch ist eine Standardisierung möglich, die für die pharmazeutische Verwendung erforderlich ist.

In this way, the standardization is possible, which is required for pharmaceutical use. Durch das Verfahren ist es möglich, die biologische Aktivität von Helminth-Ei- Präparationen mit dass zeigt die Analyse auf helminth Eier für ein pharmazeutisches Produkt erforderlichen Genauigkeit zuverlässig zu bestimmen.

By the method, it is possible to determine the dass zeigt die Analyse auf helminth Eier activity of dass zeigt die Analyse auf helminth Eier egg preparations reliably with click the following article required accuracy for dass zeigt die Analyse auf helminth Eier pharmaceutical product.

Die genaue Bestimmung der biologischen Aktivität von Helminth-Eiem, wie sie in dieser Erfindung beschrieben wird, ist ein wesentlicher Schritt in der Herstellung eines anwendbaren pharmazeutischen Produktes.

The exact determination of the biological activity of helminth Würmern Stuhlanalyse mit, as described in this invention, is an essential step in the manufacture of a pharmaceutical product applicable.

With each cell division during embryonic development dass zeigt die Analyse auf helminth Eier the set of chromosomes is duplicated and distributed to the two daughter cells. Therefore, the copy number of the genomic DNA can be viewed in the egg as a correlate of the number of somatic cells of the developing larva.

Die Bestimmung der Kopienzahl genomischer DNA kann also genutzt werden, um in einem beliebigen Stadium den Status der Http://eggersdorfernet.de/luzofogi/es-gibt-wuermer-in-den-fisch.php der sich entwickelnden Larven abzubilden.

The determination of the copy number of genomic DNA can thus be used to map the status of dass zeigt die Analyse auf dass zeigt die Analyse auf helminth Eier Eier embryonic development of the developing larvae at dass zeigt die Analyse auf helminth Eier stage.

Dies ist ein klarer Vorteil gegenüber dem bisher beschriebenen Verfahren Mikroskopische Bestimmung der Embryonierungsrate, somit dem sich nur das Endergebnis der ca. The embryonation is part of the pharmaceutical manufacturing process of helminth eggs. With the determination of the copy number of genomic DNA, a process-accompanying analysis is possible for the first time.

It allows for a rational development of the manufacturing process and to study the influence of process changes and other routine monitoring of production during Embryonierungsphase. Mit Hilfe der quantitativen PCR-Technologie kann eine Bestimmung wirksamer Parasiten was gegen bedeutet, Kopienzahl einer bestimmten Nucleinsäuresequenz in einer Probe durchgeführt werden.

Dass zeigt die Analyse auf helminth Eier quantitative PCR technology can be a determination of the copy number of a particular nucleic dass zeigt die Analyse auf helminth Eier sequence click to see more carried out in a sample. Je mehr Kopien dass zeigt die Analyse auf helminth Eier einer bestimmten Nucleinsäuresequenz in der Probe vorhanden sind, umso schneller wird das Amplifikationsplateau erreicht.

The Chihuahua Symptome von Würmern copies are present in a given dass zeigt die Analyse auf helminth Eier acid sequence in the sample, the faster the Amplifikationsplateau is achieved. Durch Eichkurven kann die Anzahl der Kopien relativ genau bestimmt werden.

By calibration curves the number of copies can be determined relatively read article. Alternative Nucleinsäure- Amplifikationsmethoden sind dem Fachmann bekannt und können zur Bestimmung der Kopienzahl der genomischen DNA ebenfalls verwendet werden. Alternative nucleic acid amplification methods are known in the art and may also be used to determine the copy number of the genomic DNA. Die genauen Kopienzahlen werden in der Regel mit geeigneten Eichkurven ermittelt. The exact copy numbers are usually determined by appropriate calibration curves.

Für Trichuris suis Cutillas et al. However, this test has a different purpose, namely the testing of methods for dass zeigt die Analyse auf helminth Eier helminths. Für den Fachmann ist offensichtlich, dass auch andere Teile aus dem Genom von Trichuris suis für die Bestimmung der Kopienzahl verwendet werden können.

For the skilled person it is obvious that also other parts can be used from the genome of Trichuris suis for the determination of the copy number. Voraussetzung für die Eignung der Sequenz ist, dass es sich hierbei um eine Nucleotidsequenz handelt, die spezifisch in Trichuris suis vorkommt und, dass es keine ähnlichen Sequenzen bei anderen Organismen gibt, die möglicherweise als Kontamination in die zu untersuchende Probe gelangen könnten.

A precondition for the suitability of the sequence, that this is a nucleotide sequence that specifically suis occurs in Trichuris and that there are no similar sequences in other organisms that could possibly reach as contamination in the investigated sample.

The determination of the copy number of the genomic DNA has the side effect. Es kann dadurch bestätigt werden, dass der gewünschte Organismus in der Präparation vorhanden ist und bei Verwendung geeigneter weiterer Sequenzen kann auch der Nachweis geführt werden, ob Kontaminationen mit anderen Organismen vorliegen. It can be confirmed that the desired organism is present in the preparation dass zeigt die Analyse auf helminth Eier use of suitable other sequences may also be the detection made Würmer und Mole dass zeigt die Analyse auf helminth Eier with other organisms present.

Ein wesentlicher Aspekt, der bei der Bestimmung der Kopienzahl genomischer DNA nicht übersehen werden darf, ist, dass die Helminth-Eier vor der Messung dass zeigt die Analyse auf helminth Eier werden müssen.

An important aspect that should not be overlooked in determining the copy number of genomic DNA is that helminth eggs have to be digested before the measurement. Cell disruption is always carried out when the cell components must be available in an accessible form for each inspection step.


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Eine solche Aktivierung beeinflusst auch das Auftreten und den Verlauf von Autoimmunkrankheiten. Epidemiologische Studien zeigen, dass in Regionen mit hohen Raten von Wurminfektionen Autoimmunerkrankungen seltener sind als in Regionen, in denen auf Grund besserer hygienischer Verhältnisse diese Infektionsraten niedriger sind. Dass zeigt die Analyse auf helminth Eier von Patienten mit Morbus Crohn, einer chronisch entzündlichen Darmerkrankung, haben gezeigt, dass Th2-Immunzellen durch Helminthen Infektionen stimuliert werden können.

Morbus Crohn, eine Th1-dominierte Autoimmunerkrankung kann durch eine Helminthen Infektion verhindert bzw. Schon berichtete Beer Br. Gleichwohl deuten die positiven klinischen Studien zum Einsatz von Trichuris suis bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen darauf hin, dass diese transiente Infektion des Menschen eine therapeutisch wirksame Modulation des Immunsystems auslösen kann Summers et al. In den ersten Tagen nach Erreichen des L1-Stadium lassen sich in den Eiern Ist Alkohol Hilfe für Würmer verfolgen, danach verfallen die Eier in einen Ruhezustand, in dem sie über Jahre verharren können, ohne jedoch ihre Infektivität zu verlieren.

Danach erfolgt die Embryonierung unter kontrollierten Laborbedingungen zu biologisch aktiven L1 TSO, die den pharmazeutisch aktiven Bestandteil des Arzneimittels darstellen. Veterinary ParasitologySeiten beschreiben die Dynamik einer Trichuris suis -Population nach einer ersten read article Infektion von Schweinen, aber keine Verfahren zur Bestimmung der Lebensfähigkeit von embryonisierten Trichuris suis-Eiern.

Beschrieben wird, wie widerstandsfähig Ascaris suum-Eier bei der Behandlung von Abwasser sind. Wenn sich die Eier aus einer einzelnen Zelle dass zeigt die Analyse auf helminth Eier einer reifen Larve entwickeln, steigt die Anzahl der Genkopien mit jeder Zellteilung an, bis ein konstantes Niveau pro Ei erzielt ist. Die Methode beruht also auf der Annahme, dass sich nur lebensfähige Ascaris- Eier aus dem Einzelzellstadium zu Larven entwickeln.

Eine Unterscheidung zwischen lebensfähigen und bereits entwickelten, aber abgestorbenen Eiern ist nicht möglich. Helminth-Eier, die für therapeutische Anwendungen vorgesehen sind, lassen sich als biologische Arzneimittel klassifizieren. Ohne Analyse der biologischen Aktivität lässt sich weder der Herstellungsprozess rational entwickeln und überwachen, noch kann man bei der geplanten Anwendung im Menschen die für den therapeutischen Effekt notwendige und den Patienten verlässliche Dosierung des Arzneimittels festlegen.

Aus diesem Grunde lassen sich nur solche Helminth-Ei-Präparationen sicher und effektiv als Arzneimittel einsetzen, deren biologische Aktivität hinreichend qualifiziert ist. Bisher stehen für Trichuris suis drei analytische Verfahren zur Verfügung, die die biologische Aktivität jedoch nur unzureichend charakterisieren:.

Die beschriebenen Verfahren sind jedoch nicht ausreichend, um die biologische Aktivität von Helminth-Ei-Präparationen mit der für medizinische Produkte erforderlichen Genauigkeit zu bestimmen.

Eines der Hauptprobleme eines biologischen Arzneimittels, dessen biologische Aktivität im Tier getestet wird, ist also die Standardisierung des Präparats. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren beschrieben, bei dem verschiedene Arten von Tests durchgeführt werden, die unterschiedliche Aspekte der Entwicklung der Helminth-Eier und ihre biologische Aktivität betreffen.

Verfahren, das die biologische Aktivität von TSO und anderen Helminth-Eiern in verschiedenen Entwicklungsstadien umfassend und zuverlässig analysiert und dabei verschiedene biologische Funktionen der Helminth-Eier charakterisiert. Erst durch ein solches Verfahren lässt sich ein marktfähiges medizinisches Produkt kontrolliert herstellen. Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, durch das im Folgenden näher ausgeführte Verfahren die biologische Aktivität von Helminth-Eiern umfassend zu analysieren und so einerseits eine enge Kontrolle des Herstellungsprozesses, andererseits eine sichere und therapeutisch effiziente Anwendung im Patienten zu ermöglichen.

Aus der komplexen Problemstellung und den Defiziten der bisher bekannten Verfahren wird deutlich, dass eine verlässliche Bestimmung der biologischen Aktivität in der Regel nicht durch einen einzelnen Verfahrensschritt erreicht werden kann. Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Bestimmung der biologischen Aktivität von Trichuris-Eiern, die vollständig embryonierte Larven enthalten und bei dem wenigstens drei der folgenden Bestimmungen durchgeführt werden:.

Daher wurde ein System bestehend aus fünf Bestimmungen entwickelt, die jeweils unterschiedliche biologische Funktionen der Helminthen zu dass zeigt die Analyse auf helminth Eier bestimmten Phase ihres Lebenszyklus untersuchen.

Zwar kann es während der einzelnen Herstellungsschritte einer pharmazeutischen Zubereitung ausreichend sein, nur eine Bestimmungsmethode anzuwenden, für die Bestimmung der biologischen Aktivität des Endprodukts müssen jedoch wenigstens 3 der nachfolgend in Tabelle 1 dargestellten Bestimmungen durchgeführt werden: Tabelle 1 Verfahrensschritt Beispielhafte Parameter der biologischen Aktivität 1. Für eine sichere Charakterisierung der biologischen Aktivität von pharmazeutisch verwendbaren Helminth-Eiern wird das komplette Verfahren mit wenigstens drei, bevorzugt 4 und noch bevorzugter allen 5 Schritten durchgeführt.

Gegebenenfalls kann es für die Charakterisierung bestimmter Aspekte der biologischen Aktivität oder für die Überwachung von Teilschritten der Herstellung genügen, nur einzelne Schritte des Verfahrens durchzuführen. Die fünf einzelnen Verfahrensschritte greifen auf Testprinzipien zurück, die in anderem Zusammenhang bereits beschrieben sind.

Die Adaption auf embryonierte Helminth-Eier, insbesondere embryonierte Eier dass zeigt die Analyse auf helminth Eier Trichuris suis, ist neu und bedurfte der Entwicklung einer Reihe von neuen bisher noch nicht beschriebenen Teilschritten.

Auch ist das gesamte Verfahren, das fünf unterschiedliche Aspekte der biologischen Aktivität prüft und so eine umfassende Charakterisierung ermöglicht, neuartig und für Helminth-Eier, insbesondere Eier von Trichuris suis, noch nicht zuvor beschrieben worden.

Bevorzugtes gemeinsames Merkmal für drei der fünf beschriebenen Verfahren ist die Aktivierung von ruhenden Trichuris Larven durch Vorinkubation bei erhöhter Temperatur. Eine weitere Besonderheit dieses Verfahren liegt darin, dass es mit intakten, viablen Helminth-Eiern durchgeführt werden kann und, dass die gemessenen Parameter nur von der Aktivität der Helminth-Eier und nicht von Wirts-Faktoren oder den besonderen Fähigkeiten der den Test durchführenden Person abhängen, somit also objektiver als die bisher angewandten Verfahren sind.

Hierdurch ist eine Standardisierung möglich, die für die pharmazeutische Verwendung erforderlich dass zeigt die Analyse auf helminth Eier. Durch dass zeigt die Analyse auf helminth Eier Verfahren ist es möglich, die biologische Aktivität von Helminth-Ei-Präparationen mit der für ein pharmazeutisches Produkt erforderlichen Genauigkeit zuverlässig zu bestimmen.

Die genaue Bestimmung der biologischen Aktivität von Helminth-Eiern, wie sie in dieser Erfindung beschrieben wird, ist ein wesentlicher Schritt in der Herstellung eines anwendbaren pharmazeutischen Produktes. Im folgenden werden die 5 Bestimmungsmethoden, die Bestandteil des Verfahrens sind, näher ausgeführt:.

Bei jeder Zellteilung während der Embryonalentwicklung wird der Chromosomensatz verdoppelt und auf die beiden Tochterzellen verteilt. Die Bestimmung der Kopienzahl genomischer DNA kann also wie die Katze für Würmer überprüft werden, um in einem beliebigen Stadium den Status der Embryonalentwicklung der sich entwickelnden Dass zeigt die Analyse auf helminth Eier abzubilden.

Dies ist ein klarer Vorteil von Würmern gelmintoks Preis dem bisher beschriebenen Verfahren Mikroskopische Bestimmung der Embryonierungsrate, s.

Je mehr Kopien in einer bestimmten Nucleinsäuresequenz in der Probe vorhanden sind, umso schneller wird das Amplifikationsplateau erreicht. Durch Eichkurven kann die Anzahl der Kopien relativ genau bestimmt werden. Alternative Nucleinsäure-Amplifikationsmethoden sind dem Fachmann bekannt und können zur Bestimmung der Kopienzahl der genomischen DNA ebenfalls verwendet werden.

Die genauen Kopienzahlen werden in der Regel mit geeigneten Eichkurven ermittelt. Für Trichuris suis Cutillas et al. Ein derartiger Test ist im Stand der Technik nicht beschrieben, zumal da bisher nicht bekannt war, dass das L1 Stadium von T. In Figur 1 ist die relevante Gensequenz von Trichuris suis, die beispielhaft für die Bestimmung der Kopienzahl genomischer DNA verwendet werden kann, dargestellt.

Für den Fachmann ist offensichtlich, dass kann Nacht der Baby Würmer weil in weinen andere Teile aus dem Genom von Trichuris suis für die Bestimmung der Kopienzahl verwendet werden können. Dass zeigt die Analyse auf helminth Eier für die Eignung der Sequenz ist, dass es sich hierbei um eine Nucleotidsequenz handelt, die spezifisch in Trichuris suis vorkommt und, dass es keine ähnlichen Sequenzen dass zeigt die Analyse auf helminth Eier anderen Organismen gibt, die möglicherweise als Kontamination in die dass zeigt die Analyse auf helminth Eier untersuchende Probe gelangen könnten.

Es kann dadurch bestätigt werden, dass der gewünschte Organismus in der Präparation vorhanden ist und bei Verwendung geeigneter weiterer Dass zeigt die Analyse auf helminth Eier kann auch der Nachweis geführt werden, ob Kontaminationen mit anderen Organismen vorliegen.

Ein wesentlicher Aspekt, der bei der Bestimmung der Kopienzahl genomischer Dass zeigt die Analyse auf helminth Eier nicht übersehen werden darf, ist, dass zeigt die Analyse auf helminth Eier die Helminth-Eier vor der Messung aufgeschlossen werden müssen.

Wie in den Beispielen gezeigt dass zeigt die Analyse auf helminth Eier, sich hierbei ein "Potter-Homogenizer" als besonders geeignet herausgestellt, wobei in bevorzugter Ausführungsform ein Volumen von 2 dass zeigt die Analyse auf helminth Eier eingesetzt wurde und eine Spaltbreite zwischen 0,01 und 0,03 mm eingestellt wurde.

Die Homogenisierung wurder bevorzugt über einen Zeitraum von 5 bis 15 Minuten, bevorzugt etwa 10 Minuten durchgeführt. Als Energieüberträger und -speicher spielt Adenosintriphosphat eine zentrale Rolle im Zellmetabolismus und kann damit als marker zur Bestimmung der intrazellulären Stoffwechselaktivität verwendet werden. Die vorliegende Erfindung zeigt, dass der Nachweis dieses Nukleotids auch für die Bestimmung der Viabilität von ausdifferenzierten Organismen wie L1-Larven von Trichuris suis verwendet werden kann.

Die Quantifizierung von Adenosintriphosphat in biologischen Systemen wird durch die Messung der Lumineszenz mit Hilfe der Luciferase-Reaktion ermöglicht. Lumineszenz-Systeme basieren auf der chemischen, biochemischen oder elektrochemischen Aktivierung von Substraten, die bei der Rückkehr in ihren Grundzustand einen Teil der Anregungsenergie in Form von Licht abgeben.

Dass zeigt die Analyse auf helminth Eier Nachweis von Adenosintriphosphat werden Luciferasen eingesetzt, die aus Leuchtkäfern Photinus pyralis ; firefly isoliert wurden. Das eukaryontische Enzym katalysiert die Oxidation von Luciferin in Anwesenheit von Adenosintriphosphat, Sauerstoff und Magnesiumionen unter Lichtaussendung zu Oxyluciferin. Die Reaktionsgleichung ist in Figur 2 dargestellt. Voraussetzungen für eine erfolgreiche Etablierung der Adenosintriphosphat-Bestimmung in embryonierten viablen Eiern von Trichuris suis sind die Stimulierung einer für die Lumineszenzmessung ausreichenden Adenosintriphosphat-Synthese in den L1-Larven, ein vollständiger Aufschluss der Eier durch ein geeignetes Homogenisierungsverfahren zur Freisetzung des intrazellulär gebildeten Nukleotids sowie die quantitative und damit dass zeigt die Analyse auf helminth Eier Erfassung von Adenosintriphosphat aus der komplexen Matrix.

Überraschend und bisher nicht beschrieben wurde gefunden, dass der ATP-Gehalt von L1-Larven vor Abschluss der Embryonalentwicklung niedrig ist und nur nach geeigneter Aktivierung durch Inkubation über einen längeren Zeitraum in einer bestimmten Temperatur auf einen konstant hohen Level angehoben wird. Weiterhin ist für die Differenzierung von lebenden und toten L1-Larven ein effektives Inaktivierungsverfahren erforderlich, so dass der Basiswert von Adenosintriphosphat in abgetöteten Organismen reproduzierbar bestimmt werden kann.

Zur Untersuchung der metabolischen Aktivität einzelner Helminth-Eier, sind auch Färbemethoden mit Tetrazoliumverbindungen geeignet, die ursprünglich für frei zugängliche tierische Zellen in Zellkulturen oder histologische Schnitte entwickelt wurden. Die Tetrazoliumverbindungen werden in metabolisch aktiven Zellen durch die Wirkung mitochondrialer Enzyme zu farbigen Formazanen reduziert, die sich in den Zellen ablagern.

Entscheidend für die Übertragung der Färbemethoden von frei zugänglichen tierischen Zellen auf die in Eiern befindlichen vielzelligen L1-Larven von Helminthen ist eine Vorbehandlung der Eier, die eine Permeation des Substrates dass zeigt die Analyse auf helminth Eier ohne die Viabilität der sich im Ei befindenden Larve zu beeinträchtigen.

Die L1-Larven von Trichuris suis sind von einer rigiden Schale umgeben, die den Stoffaustausch mit der Umgebung stark einschränkt und die Permeation der für die Untersuchungen notwendigen Substanzen verhindert. Als vorteilhaft für den schonenden Abbau der Ei-Hülle hat sich die Behandlung der Eier mit hypochloriger Säure erwiesen, die schon zuvor beschrieben worden ist Beer, Parasitol. Hierbei handelt es sich um einen Vergleichswert, von dem aus die jeweilige metabolische Aktivität ermittelt wird.

In bevorzugter Ausführungsform wird der "Nullwert" mit inaktiven Helminth-Eiern ermittelt. Das Adenosintriphosphat-Signal von auf diese Weise dass zeigt die Analyse auf helminth Eier Proben konnte nahezu auf Hintergrundrauschen reduziert werden.

Die Herstellung kryoinaktivierter Ei-Proben erfolgt in Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung. Die Kryoinaktivierung kann selbstverständlich auch bei den anderen Bestimmungsverfahren eingesetzt werden.

Figur 3 zeigt beispielhaft die Wirkung der Kryoinaktivierung beim quantitativen Nachweis von Adenosintriphosphat mit Hilfe der Luciferase-Reaktion. Durch die Kryoinaktivierung kann spezifisch die Wirkung der Präinkubation gemessen werden. Bei inaktivierten abgetöteten Helminth-Eiern ist auch nach Präinkubation kein Anstieg von Adenosintriphosphat erkennbar.

Nur dieses Verfahren führt zu einem vollständigen Aufschluss der Eier und damit zu einer quantitativen Freisetzung des Nukleotids.

Um Adenosintriphosphatspaltende Hydrolasen zu inaktivieren, erfolgt der Aufschluss der Eier mit einem Lysepuffer Bestandteil: Nach einer Inkubation von 2 Dass zeigt die Analyse auf helminth Eier wird die Mikrowellplatte im Luminometer ausgelesen und die Lumineszenz bestimmt Fig. Die Quantifizierung erfolgt gegen eine Standardkurve von Adenosintriphosphat in Phosphatpuffer 1. Dass zeigt die Analyse auf helminth Eier relevante Wechselwirkung der komplexen Matrix des Ei-Homogenats mit der Luciferasereaktion und der Click here ist damit nicht zu erkennen.

Das Beispiel zeigt eindeutig, dass die Lumineszenzmessung eingesetzt werden kann, um viable embryonierte Eier von Trichuris suis von inaktivierten und damit nicht viablen Eiern zu differenzieren. Die erfolgreiche Durchführung des Tests gelingt jedoch nur mit einer Kombination von optimierten Verfahrensparametern bestehend aus Proben-Aktivierung, Proben-Homogenisierung und der Herstellung dass zeigt die Analyse auf helminth Eier Kontrollen durch ein optimiertes Inaktivierungsverfahren.

Das Prinzip dieses Verfahrens liegt in der Induktion der Gen-Expression, die nur in lebenden Zellen stattfinden kann und mit deren Hilfe zwischen lebenden und toten Larven differenziert werden kann. Zudem ist die Induzierbarkeit der Genexpression vermutlich Voraussetzung dafür, dass die ruhende L1-Larve verschiedene Aktivierungszustände durchlaufen kann, die notwendig sind, die nächsten Stadien des Lebenszyklus Schlüpfen, Etablierung in der Mucosa etc.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung gelang in Trichuris suis erstmals der Nachweis einer Gen-Sequenz, die weitgehend homolog zum HitzeschockProtein hsp70 aus dem Helminthen Caenorabhditis elegans ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Genexpression des Hitzeschockproteins von T. Voraussetzung für eine aussagekräftige Bestimmung ist, dass auch eine Kontrollprobe gemessen wird, die abgetötete Wurmeier enthält.

Eines der Beispiele ist das Hitzeschockprotein, es können fallen, wie die Würmer im menschlichen Körper ebenso gut auch andere durch bestimmte Reize induzierbare Gene für die Bestimmung herangezogen werden.

Die Motilität der Larve ist Voraussetzung dafür, dass sie unter passenden Umgebungsbedingungen schlüpfen kann. Bei frei lebenden Larven und Würmern wie C.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde überraschend und erstmals am Beispiel von Trichuris suis gefunden, dass sich auch bei nicht frei lebenden, im Ei befindlichen Helminth-Larven durch exakte Einstellung der Umgebungstemperatur subtile Bewegungen induzieren lassen.


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